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实验中Sirt1靶点3大检测详解

发布时间:2021-03-24浏览:165次
  Sirt1是什么?
 
  Sirt1是一个全长747aa的NAD依赖的脱乙酰化酶, 属于sirtuin家族。翻译后修饰的SIRT1是一个110-130kda的蛋白质,包含一个脱乙酰酶sirtuin型结构域。TNF-alpha处理可诱发C末端缺失的75-80kda的SirT1片段, 另外SirT1存在一个57-61kda的亚型。SIRT1可能存在于核仁、核常染色质、异染色质和内膜中。它能在细胞核和细胞质之间穿梭。SIRT1通过催化关键蛋白的去乙酰化来调节细胞凋亡和肌肉分化等过程,在氧化应激和DNA损伤修复中发挥重要作用。
 
sirt1参与的生理过程
一、Sirt1的WB检测
 
  在 Western Blot 实验中,样本准备是实验成功的di一步。
 
  1.裂解样本时加入足量的蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
 
  2.该蛋白高度修饰,分子量达到130kd,可在转膜液中加入终浓度 0.1% 的 SDS 以提高转膜效率。
 
  3.使用 Bradford,Lowry 或 BCA 法对总蛋白进行定量。每个泳道加入 20-50μg 总蛋白,确保sirt1含量在 WB 检测限之上。
 
  背景过高是 Western Blot 中常常出现的问题。对于此类问题,建议优化抗体浓度以获得较佳的信噪比,使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行WB检测结果如下:
 
Western blot-FNab07877 anti- SIRT1 antibody
二、Sirt1的IHC检测
 
  组织块从生物体上取下后由于酶的作用会迅速降解。所以需要通过化学试剂的作用使蛋白交联(多聚甲醛,福尔马林等),防止组织自溶,维持抗原性并防止抗原弥散。但是过度固定会封闭抗原表位,导致信号减弱甚至消失。另外,一抗的浓度对于实验结果非常重要。浓度过低得不到阳性信号,浓度过高可能产生非特异性结合,造成假阳性。
 
  Sirt1定位于细胞核,为获得理想的染色结果,建议:
 
  1.根据组织块大小和类型确定固定时间,一般在4% 多聚甲醛(PFA)固定 18-24 小时。
 
  2.推荐使用 pH 6 的枸橼酸钠,热修复 20-30 分钟或使用胰蛋白酶、蛋白酶 K 进行酶修复。
 
  3.若切片厚度大于 5μm,推荐使用 0.2% Triton X-100 PBS 对切片进行通透处理 10 分钟。使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行IHC检测结果如下:
 
Immunohistochemistry-FNab07877 anti- SIRT1 antibody (200倍放大)
三、Sirt1的IF检测
 
  相比于与组织切片,培养的细胞需要固定的时间更短,同时醛基的自发荧光对于荧光检测常常带来干扰。
 
  为了获得更好的实验结果,推荐:
 
  1.使用 4% PFA 固定细胞 20 分钟,过度固定会使信号减弱。
 
  2.使用 0.3M 甘氨酸淬灭醛基引起的自发荧光。
 
  3.检测细胞核内抗原Sirt1时,使用 0.1% Triton X-100 对细胞进行 5 分钟的通透处理。使用菲恩生物FNab07877 anti- SIRT1 antibody进行IF检测结果如下:
 
Immunofluorescence-FNab07877 anti- SIRT1 antibody (200倍放大)
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