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总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)

简要描述:菲恩生物总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)用于测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液,细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力,以及植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力。

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名称:总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法) Total Antioxidant Capacity Assay Kit (FRAP)介绍:√ 活性氧(Reactive oxygen species,ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧,同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后,可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤,诱发氧化应激(Oxidative stress),继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。
机体中存在多种抗氧化物,包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等,可以清除体内产生的各种活性氧,以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液,细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。
√ 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱,可以用于筛选强抗氧化能力的药物。
FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ,随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行,可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM,因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的,样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。
√ 抗氧化剂
Fe3 + -TPTZ ——————> Fe2 + -TPTZ(蓝色)
√ 该试剂盒的抗氧化能力与Trolox相当。Trolox是一种水溶性维生素E类似物,可作为抗氧化剂标准。货号:K025存储:该套件使用冰袋运输,建议在-20℃下保存。保质期为12个月,避光。套件组分:在打开之前,将小瓶短暂离心。使用超纯水制备试剂。为了保持试剂的完整性,请避免重复冷冻/融化循环。
 

TPTZ稀释剂15ml(毫升)
TPTZ溶液1.5ml(毫升)
检测缓冲液0.5ml(毫升)
FeSO4•7H2O200mg(毫克)
Trolox标准版,10mM0.1ml(毫升)

总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)操作步骤:

1.向所有标准孔和样品孔中添加180ul FABP工作溶液。
2.分装5ul 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM标准溶液到标准孔中。
3.加入5ul 的ddH 2 O或PBS到对照(零)孔中。
4.加入5ul 0.15-1.5mMTrolox到样品孔中作为阳性对照; 将每个样品5ul 加入其他样品孔中。
5.用盖密封板并在37°C下孵育3-5分钟。在593 nm(A593)处测量吸光度。如果难以测量A593,则可以在585-605nm范围内进行测量。
6.根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力。如果样品的吸光度超出标准曲线,则应稀释样品然后测定。
7.对于FRAP方法,总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度表示。例如,如果血浆或血清样品的吸光度与1mM FeSO4的吸光度相同,则血浆或血清样品的总抗氧化能力为1mM;如果细胞匀浆的测定吸光度与0.3mM FeSO4的吸光度相同,并且蛋白质浓度为0.15mg/ml,则细胞匀浆样品的总抗氧化能力为0.3mM/0.15mg/ml,即2mmol/g;如果测得的0.2mM抗氧化剂的吸光度与1mM FeSO4的吸光度相同,则相对总抗氧化剂容量为5。程序:所有样品和标准品应一式双份操作。FRAP工作溶液的制备:请参考下表,根据要测量的样品数量(包括标准曲线)来制备适量的FRAP工作溶液:

样品数15102050
TPTZ稀释剂150ul(微升)750ul(微升)1500ul(微升)3000ul(微升)7500ul(微升)
TPTZ解决方案15ul(微升)75ul(微升)150ul(微升)300ul(微升)750ul(微升)
 
混合均匀,然后添加缓冲液
检测缓冲液15ul(微升)75ul(微升)150ul(微升)300ul(微升)750ul(微升)
FRAP工作解决方案180ul(微升)900ul(微升)1800ul(微升)3600ul(微升)9000ul(微升)

FRAP工作液应在37℃下孵育,并在1-2小时内使用。
比色检测标准:√ 取试剂盒提供的27.8 mg FeSO4•7H2O,溶解并保持体积为1 ml,此时FeSO4•7H2O的浓度为100 mM。然后用PBS将100 mM FeSO4•7H2O稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。
√ FeSO4溶液应新鲜配制。100mM FeSO4溶液易于氧化为三价铁,使颜色从初的浅绿色逐渐变为浅黄色。如果颜色是黄色,则放弃并重新配制溶液。样品制备:1.血清,血浆,唾液,尿液和培养基样品可以直接添加到孔中。对于血浆样品,建议使用肝素或柠檬酸钠而不是EDTA进行抗凝。根据文献,人血清或血浆的总抗氧化能力为0.5-2mM,唾液为0.3-1mM,尿液为0.2-3mM。
2.对于细胞或组织样品,可以将制备的细胞或组织样品的上清液直接添加到孔中。同时,应测试蛋白质浓度。终确定的总抗氧化剂容量通常表示为每克或每微克蛋白质的总抗氧化剂容量,单位为mmol / mg或mmol / g。
3.对于其他样品,可以将植物提取物或中草药提取物直接添加到孔中,总抗氧化剂容量可以表示为mmol / mg或mmol / g。如果抗氧化剂的浓度可以表示为摩尔浓度,则所测量的总抗氧化剂容量可以通过相对总抗氧化剂容量来表示。例如,测得的0.5mM抗氧化剂的吸收度与1mM FeSO4的吸收度相同,相对总抗氧化剂容量为2。

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